一般我們購(gòu)買(mǎi)商品化的primary antibody的時(shí)候，抗體的說(shuō)明書(shū)中都會(huì)給我們一個(gè)推薦的抗體使用濃度。這個(gè)濃度在一定程度上來(lái)說(shuō)，是過(guò)飽和的，可以滿足大多數(shù)實(shí)驗(yàn)的染色需求。

但是因?yàn)槭沁^(guò)飽和的濃度，這就帶來(lái)了一定程度的抗體浪費(fèi)。而過(guò)量的抗體，也會(huì)大大提高樣本的自發(fā)熒光。

從另一個(gè)角度來(lái)看，因?yàn)閺S家給出的推薦濃度都是基于一個(gè)特定的樣本濃度和樣本體積，所以在一些特殊的實(shí)驗(yàn)中，比如樣本濃度或樣本體積過(guò)大的實(shí)驗(yàn)，推薦的濃度就無(wú)法達(dá)到飽和滴加的要求。在這樣的前提下，推薦實(shí)驗(yàn)用戶針對(duì)自己的實(shí)驗(yàn)要求，zui好可以對(duì)抗體進(jìn)行滴定。節(jié)約成本的同時(shí)，也可以讓自己的實(shí)驗(yàn)更加。

滴定的原則：

1. 在進(jìn)行滴定實(shí)驗(yàn)前，應(yīng)該遵守一個(gè)實(shí)驗(yàn)一個(gè)變量的原則。既然滴定實(shí)驗(yàn)要求的是摸索出準(zhǔn)確的抗體工作濃度，那在制作樣本前，也需要對(duì)其他的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行統(tǒng)一。而這些在滴定實(shí)驗(yàn)中的條件，也應(yīng)該沿用到后續(xù)的正式實(shí)驗(yàn)中去。

2. 需要統(tǒng)一的條件：樣本，樣本數(shù)量/管，樣本體積/管，孵育條件等?？偟膩?lái)說(shuō)，一個(gè)成功的滴定實(shí)驗(yàn)，只應(yīng)該有“抗體的終濃度不同”這一個(gè)實(shí)驗(yàn)中的變量。

3. 滴定的稀釋倍數(shù)：一般按照5倍稀釋的標(biāo)準(zhǔn)做5個(gè)梯度的原則做滴定實(shí)驗(yàn)。也可根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。起點(diǎn)濃度的選擇則需要按照具體的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行分析。比如，對(duì)于PBMC或者裂解后的全血、脾臟之類(lèi)的樣本，活細(xì)胞比例高，單管樣本一般以1*10^6為上限。可以從推薦用量開(kāi)始，往下5倍稀釋?zhuān)?個(gè)梯度。但是有些原代細(xì)胞，比如涉及腫瘤免疫方面的樣本，活細(xì)胞比例低，免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)比例低，所以制備的樣本數(shù)量也會(huì)比較大，這個(gè)時(shí)候，也可以選擇超過(guò)推薦的濃度滴加，然后再進(jìn)行梯度稀釋。

4. 滴定實(shí)驗(yàn)完成后，通過(guò)計(jì)算染色指數(shù)（stain Index）確定zui佳抗體濃度。染色指數(shù)公式如下：

示例：

我們以anti-human CD3抗體舉例：在100ul全血樣本中，我們以該抗體推薦的用量5ul/tube 為高濃度，5倍稀釋?zhuān)⒃O(shè)置5個(gè)梯度。高濃度至低濃度分別是5ul/100ul blood，1ul/100ul blood，0.2ul/100ul blood，0.04ul/100ul blood，0.008ul/100ul blood。通過(guò)計(jì)算，染色指數(shù)由高濃度到低分別為98.57，106.29，96.97，12.36，8.58。從染色指數(shù)上看，我們挑選出zui優(yōu)的抗體濃度為1ul/100ul blood。即為推薦用量的1/5。

用第三方軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)疊加可以一目了然。

注意事項(xiàng)：

1. 對(duì)于一些陽(yáng)性表達(dá)幾乎100%的細(xì)胞，比如PBMC中的CD45,可以在樣本染色后少量加入未染色的細(xì)胞。

2. 對(duì)于表達(dá)量比較少的稀有細(xì)胞群體，在染色時(shí)，可加入該群細(xì)胞的父級(jí)細(xì)胞群的抗體。在設(shè)計(jì)多色實(shí)驗(yàn)的滴定時(shí)，zui好可以分批滴定。將表達(dá)量高的抗體先進(jìn)行滴定。確定zui佳濃度后，再滴定表達(dá)量少的抗體，并將已經(jīng)滴定好的抗體一同加入。比如我們?cè)诘味ㄍ庵苎械膄oxp3時(shí)，zui好可以加入已經(jīng)確定好濃度的CD4抗體。

3. 對(duì)于消化的組織來(lái)說(shuō)，因?yàn)榇嬖诖罅康乃兰?xì)胞，所以在這些樣本的滴定過(guò)程中，要先加入死活染料區(qū)分死活，再確定目標(biāo)抗體的濃度。

4. 是否需要在滴定前blocking？取決于正式實(shí)驗(yàn)。如果正式實(shí)驗(yàn)是封閉的，那么滴定實(shí)驗(yàn)也需要。

5. 遇到不同廠家，不同貨號(hào)，不同克隆號(hào)的抗體，需要重新滴定。

6. 滴定完成后，理論上只要cat號(hào)一致，lot號(hào)不一致，不需要重新滴定。但是為了保險(xiǎn)起見(jiàn)，每一瓶抗體，特別是不同lot的抗體，zui好留一個(gè)樣本的抗體量，以方便日后的QC或者實(shí)驗(yàn)復(fù)盤(pán)。